|
الف – معرفی انواع محیط های کشت میکروبی وطرز تهیه آن ها
ب- آماده سازی واستریل کردن محیط های کشت میکروبی
ج- باز آموزی واجرای تکنیک رنگ آمیزی گرم
معرفی انواع محیط های کشت میکروبی وطرز تهیه آن ها
محيط هاي كشت را از نظر قوام به سه گروه تقسيم مي كنيم:
¨ اولين گروه مايع هستند كه براث ناميده مي شوند مانند نوترين براث- مولر هينتون براث
در اين نوع محيط هاي كشت كه به صورت سوسپانسيون هستند حركت ديده نمي شود.
¨ دومين گروه جامد هستند كه آگار ناميده مي شوند مانند نوترين آگار- مولر هينتون آگار
¨ سومين گروه محيط كشت هاي نيمه جامد هستند که مقدار آگار آن ها نسبت به محيط جامد كمتر است (1 تا5% آگار دارند).
اين نوع محيط هاي كشت زماني استفاده مي شوند كه بخواهيم حركت باكتري ها را مشاهده كنيم.
انواع محيط هاي كشت:
- ساده :دراين محيط ها باكتري هايي رشد مي كنند كه نياز غذايي حداقل دارند .مثلاً در نوترين، استاف رشد مي كند.
- غني شده: باكتري هايي رشد مي كنند كه نيازبه غذاهاي مقوي تر دارند. براي غني كردن روي محيط پايه، مواد غذايي ديگري اضافه مي كنيم .مثل محيط كشت بلاد آگار(خون افزوده مي شود)
- اختصاصي : در اين نوع از محيط هاي كشت موادي (مثلا آنتي بيوتيك خاص، رنگ ، املاح صفراوي و...) وجود دارد تا مانع رشد برخي از باكتري ها شود وآن را براي رشد گروه خاصي از باكتري ها مختص نمايد. به طور مثال:
استرپ مي تواند در محيط كشت بلاد آگار كه با كريستال ويوله اختصاصي شده رشد كندولي استاف نمي تواند رشد نمايد.
اشرشيا كلاي چون گرم منفي است مي توان در محيط كشت EMB(ائوزين متيلن بلو) آن را از بقيه گروه هاي باكتري ها جدا كرد ، چون مي تواند در EMB رشد كند.
- افتراقي: باكتري هايي كه در اين محيط كشت رشد مي كنند را مي توان از نظر برخي مشخصات از هم تفكيك نمود.
مثلاً EMB در عين حال كه محيط كشت اختصاصي جهت باكتري هاي گرم منفي است محيط كشت افتراقي نيزمي باشد.در اين محيط باكتري هاي گرم منفي لاكتوز مثبت مانند اشرشيا كلاي، كلني رنگي و باكتري هاي گرم منفي لاكتوز منفي ، كلني شفاف ايجاد مي كنند.
- انواع ديگري ازمحيط هاي كشت نيز وجود دارد مانند: محيط كشت غني كننده ، محيط كشت ترانسپورت و...
آماده سازی واستریل کردن محیط های کشت میکروبی
معمولاً مواد محيط هاي كشت مختلف به صورت پودر هاي آماده در ظروفي به طور تجاري تهيه شده اند وقابل خريداري ودر دسترس مي باشند. فرمولاسيون ونحوه آماده سازي هر محيط كشت بر روي برچسب ظروف مربوطه نوشته شده است.
در اين جا به عنوان نمونه، به نحوه آماده سازي محيط كشت نوترين آگار مي پردازيم.
* نحوه آماده سازي محيط كشت N. A (نوترين آگار):
8/2گرم ماده نوترين آگار را در 100سي سي آب مقطر حل كرده ودر ارلن استريل مي ريزيم. معمولاً حجم ارلن بايد دوبرابر حجم محلول محيط كشت باشد كه در زمان حرارت وبه جوش آمدن، سرريز نگردد. آگار در 94 درجه سانتي گراد حل مي شود، پس براي انحلال كامل آن بايد محلول را تا حد جوشيدن حرارت دهيم. بهترين روش براي جلوگيري از ته گرفتن محيط كشت وانحلال بهينه، قرار دادن آن در بن ماري جوش است. حرارت دادن بايد تا شفاف شدن كامل محلول ادامه يابد. پس از آن درب ارلن رابا فويل آلومينيومي يا پنبه يا گاز استريل مسدود مي نماييم وجهت استريل كردن كامل، ارلن را در اتوكلاو قرار مي دهيم.
(اگر محيط كشت براث (مايع) بود بايستي محلول را مستقيماً در لوله آزمايش ريخته، درب آنها را با پنبه استريل مسدود ودر اتوكلاو قرار دهيم.)
ارلن محتوي محيط كشت شفاف شده رادر اتوكلاو در دماي 121 درجه درفشار15پوند(2اتمسفر) به مدت15 الي 20 دقيقه قرارداده وقتي دما به50 درجه رسيد آن را از اتوكلاوخارج می نماییم در كنار شعله به پليت هاي استريل انتقال مي دهيم به طوري كه حدوددوسوم حجم پليت را پركند وبلافاصله درب پليت ها را مي بنديم.پس از جامد شدن محيط كشت كه چند دقيقه اي طول مي كشد ، محيط مذكور جهت انتقال ميكروب ها وكشت آنها آماده است.
*اجرای تکنیک رنگ آمیزی گرم
براي انجام اين بخش از فعاليت ها از دونمونه كشت يافته اشرشيا كلاي (نمونه اي از باكتري هاي گرم منفي ) واستافيلوكوكوس اورئوس (نمونه اي از باكتري هاي گرم مثبت ) استفاده شد.
مراحل كار به ترتيب:
1- استريل كردن لوپ روي شعله 2- برداشتن نمونه با لوپ 3- گسترش روي يك لام تميز 4- فيكس كردن كنار شعله
5- افزودن كريستال ويوله به مدت يك دقيقه 6- شستشو با آب مقطر 7- افزودن لوگول به مدت يك دقيقه
8- شستشو با آب مقطر 9- افزودن الكل استن به مدت 10-15 ثانيه 10- شستشو با آب مقطر 11- افزودن سافرانين (يا فوشين) به مدت 30-45 ثانيه 12- شستشو با آب مقطر، خشك كردن ومشاهده در زير ميكروسكوپ(پس از رنگ آميزي گرم باكتري هاي گرم مثبت به رنگ بنفش يا آبي و باكتري هاي گرم منفي به رنگ قرمز يا صورتي مشاهده مي شوند.)
|
